??從紅豆杉樹皮浸膏中提取紫杉醇初分離工藝的研究 　　紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是當(dāng)今重要的抗癌新藥。早在1971年，Wani等就從紅豆杉樹皮中發(fā)現(xiàn)并分離出了種物質(zhì)。由于它特異的臨床抗癌療效，1992年被美國FA D批準(zhǔn)為治療晚期乳腺癌的特效藥而上市。
??然而，在實(shí)際藥物生產(chǎn)中，紫杉醇的大規(guī)模制備仍存在許多問題。首先，紫杉醇來源匱乏，其主要存在于紅豆杉樹皮和針葉中，其次，紫杉醇在植物中含量極低，大約為0。010%~0。013%，而紫杉醇與其它紫杉烷化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性等方面又極為相似，要將它們完全分離困難很大。
?? 　　關(guān)于紫杉醇提取分離方法，已有過不少的研究。其中以液-液萃取應(yīng)用最為廣泛，在文獻(xiàn)報(bào)道的每一種工藝中，幾乎都采用過它。Willey等和Mattina等在測定樣品中紫杉醇濃度時(shí)，選擇了固相萃取作為HPLC分析的預(yù)處理。以分子間吸附為機(jī)理的硅膠柱層析，是制備紫杉醇最常用的方法之一。
??1984年，Senilh等曾采用氧化鋁柱層析處理紅豆杉浸膏，但所報(bào)道的分離效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制備薄層層析來少量獲取紫杉醇。本研究的目的，在于尋找一條切實(shí)可行的工藝路線，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的紅豆杉資源；采用一些高效、經(jīng)濟(jì)的提取分離方法，減少過程步驟，快速、簡捷地提取出紫杉醇。
?? 　　1 材料方法 　　1。1 材料 　　紅豆杉樹皮提取浸膏，云南張峰植物加工廠；紫杉醇對照品，純度大于95%，Sigma；固相萃取柱（C18填料，10ml），大連化學(xué)物理研究所；GF254硅膠和粗孔硅膠（100~140目），青島海洋化工廠；層析氧化鋁（200~300目），上海新誠精細(xì)化學(xué)品有限公司。
?? 　　DU-7紫外/可見分光光度計(jì)及FL-750HPLC儀，Beckman公司；XZ-6A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，北京科龍儀器公司；常壓層析系統(tǒng)，Pharmacia公司。 　　1。2 方法 　　1。2。1 液-液萃取 稱取紅豆杉樹皮浸膏于錐形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比為 1：50），充分溶解，再加入與CH2Cl2等量的水，充分混合后靜置分層，分液回收有機(jī)相，棄水相。
??有機(jī)相再加水萃取，重復(fù)三次。將有機(jī)相中的CH2Cl2減壓 蒸出回收，所得固相物溶解于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 　　1。2。2 固相萃取 固相萃取過程包括四步驟，即固定相活化、樣品上柱、淋洗、樣品的洗脫。全過程將速度穩(wěn)定控制在5~8ml/min。
??固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。依資助加入甲醇10ml和0。01mol/L(pH5。0)的乙酸銨緩沖液10ml（乙酸銨水溶液），將液面維持在膠層上1~2mm。上樣及淋洗：將樣品溶于80%~90%的甲醇乙酸銨溶液中，取0。5ml加入柱中，抽空。
??依次用0。01mol/L的乙酸銨溶液10ml、50%的甲醇乙酸銨溶液淋洗，抽空。紫杉醇的洗脫：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸銨溶液10ml，收集洗脫液，減壓蒸發(fā)。從洗脫液蒸發(fā)所得的固體物中取樣，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。 　　1。
??2。3 硅膠柱層析 硅膠用CHCl2浸泡，超聲波脫氣5min，重力沉降法裝柱（15mm-×260 mm），用CHCl2充分洗出硅膠中的雜質(zhì)至柱床透明。樣品溶解于CHCl3后上柱，再用CHCl3充分洗去未被吸附的雜質(zhì)，然后用3：97（v/v）的CH3OH：CHCl3進(jìn)一步洗脫，收集洗脫峰，HPLC 測定紫杉醇的濃度和純度。
??柱層析過程在常溫常壓下操作。 　　1。2。4 氧化鋁柱層析 CH3OH、CHCl3用分子篩脫水，層析用氧化鋁190℃真空干燥6h后，用脫水CHCl3浸泡，超聲波脫氣5min，裝成15mm×260mm的層析柱。清洗柱后上樣，用CHCl3洗去未被吸附的雜質(zhì)，再用1%的CH3OH、CHCl3（v/v）淋洗，最后用5%的CH3OH溶液洗脫出紫杉醇。
??HPLC測定其純度，柱層析過程在常溫常壓下操作。 　　1。2。5 制備薄層層析 用GF254硅膠自制100mm×200mm層析薄板，105℃活化0。5h，樣品用 CH3OH溶解，配成10mg/ml的溶液。毛細(xì)管點(diǎn)樣，成線狀，每板點(diǎn)樣量在2mg左右。
??在對照板中點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，用氯仿-甲醇（95：5）展開，254nm紫外光下確定紫杉醇的Rf值。切割并收集制備板上的紫杉醇帶，用CH3OH洗脫下硅膠上吸附的紫杉醇，HPLC測定其純度。 　　1。2。6 紫杉醇的定量定性分析 采用HPLC對紫杉醇作定性定量分析：4。
??6mm×250mm的C18 柱，檢測波長為227nm，等梯度洗脫，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（20：32：48），流速1。0ml/m in。以紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品為對照，外標(biāo)法作定量分析。 　　2 結(jié)果及分析 　　　2。1 液-液萃取 　　以1：1的二氯甲烷-水對粗品液-液萃取，紫杉醇富集到有機(jī)相。
??實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相與水相的分層速度慢，并有乳化現(xiàn)象。液-液萃取的紫杉醇回收率為94。6%，紫杉醇含量從0。65 %提高到1。23%。液-液萃取的缺點(diǎn)在于產(chǎn)生的廢水較多?！　?。2 固相萃取 　　用50%的CH3OH洗滌，紫杉醇不會(huì)被洗下，而濃度加大到80%，即可將紫杉醇從萃取柱洗脫。
??樣品經(jīng)一步固相萃取，紫杉醇濃度可提高8。9倍，回收率為100%。與液-液萃取相比較，固相萃取的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在快速、簡單、便于自動(dòng)化。同時(shí)，固相萃取的分離效率明顯高于液-液萃取。　　2。3 硅膠柱層析　　紫杉醇在硅膠柱上的保留較強(qiáng)，用CHCl3淋洗時(shí)，紫杉醇不被洗出。
??而用3%的CH3-OH：C HCl3（v/v）洗脫，可分離出兩個(gè)峰。HPLC分析表明，其中的第二個(gè)峰，即圖1中峰1為紫杉醇。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在層析流動(dòng)相中添加0。05%4 水時(shí)，分離出的紫杉醇純度有所提高，分離速度也能顯著加快。經(jīng)硅膠柱層析，能獲得純化20倍以上、純度大于14%、回收率大于98%的紫杉醇。
??　　2。4 氧化鋁柱層析 　　紫杉醇在氧化鋁柱上的保留和分離大致相同。用最佳流動(dòng)相和高活性（即含水量低）的吸附劑分離芳烴異構(gòu)體，氧化鋁柱往往要比硅膠效果好得多。用5%的甲醇洗脫，可將大部分紫杉醇洗出。Carver等認(rèn)為，氧化鋁能使糖基化的紫杉醇轉(zhuǎn)化為紫杉醇，從而增加了紫杉醇的總量，使紫杉醇的回收率可能大于100%。
??我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，這一現(xiàn)象的確切原因還有待于深入探索。 　　2。5 制備薄層層析 　　硅膠薄層層析（TLC）原理與硅膠柱層析原理一致。TLC可將樣品分離出11條以上的色帶，紫杉醇帶在薄板的中部（Rf≈0。5），呈現(xiàn)紫紅色。應(yīng)用TLC純化紫杉醇，一步可將紫杉醇含量從0 。
??65%提高到13。9%，回收率為99。7%?！　?。6 預(yù)處理的比較 　　各處理步驟比較如表1。表1中數(shù)據(jù)可知，以氧化鋁柱層析純化紫杉醇的效率最高。氧化鋁介質(zhì)便宜，能充分利用有限的紅豆杉原料，是一可行的純化紫杉醇方法。其次是硅膠柱層析，浸泡好的硅膠半透明，在玻璃層析柱上能觀察到層析進(jìn)展情況，操作很直觀。
??TLC的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、有機(jī)溶劑消耗很少。但TLC處理量較小，工業(yè)放大困難。固相萃取的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在簡單、便于自動(dòng)化、能顯著減少溶劑的用量。

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